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Utilização de plasma rico em plaquetas em enxertos ósseos - proposta de um protocolo de obtenção simplificado


João José Lemos
- Mestre em Implantodontia - Periodontia da UNISA

Renato Rossi Junior
- Professor de Patologia na Universidade de Santo Amaro, SP
- Especialista em Implantodontia, Patologia e Cirurgia Maxilofacial
- Consultor científico da 3I Implant Innovations, Inc - USA para o Brasil
- Coordenador do Curso de Especialização de Implantodontia do Sindicato dos Odontologistas de São Paulo
- Coordenador da Pós-graduação da UNISA-SP na área de Diagnóstico Bucal.
- Editor da revista Innovations Magazine, de Implantodontia.

Ronaldo Píspico
- Mestrandos em Implantodontia, Periodontia da UNISA


A reconstrução dos maxilares é única comparada com a dos outros ossos por causa das diferentes demandas destas estruturas em função. Ao contrário dos ossos longos do corpo, um maxilar reconstruído deve suportar as forças de cisalhamento ao invés das forças de compressão, e ser capaz de suportar implantes e próteses dentais ao invés do peso produzido. Na década de 80, os grandes laboratórios de pesquisa procuraram investigar a possibilidade da utilização de mediadores químicos na modulação do processo de reparo dos enxertos ósseos. Muitos fatores de crescimento foram identificados, isolados, e testados quanto a sua capacidade de iniciar o crescimento ósseo. Os autores propõem um protocolo de obtenção de Plasma Rico em Plaquetas utilizando uma centrifuga convencional. Os resultados permitiram ao autor concluir: 1 – Os fatores de crescimento ósseo são fundamentais no reparo dos enxertos ósseos. O uso destes fatores de crescimento têm muitas vantagens, inclusive redução do tempo necessário para formação de osso novo bem como aumento do trabeculado obtido no reparo. 2 – O Plasma Rico em Plaquetas obtido de forma autógena pelo protocolo simplificado proposto pelo autor é um auxiliar importante e seguro nas cirurgias de enxertos maxilares.
Untitled Document Introdução

O processo de reparação dos enxertos ósseos depende de vários fatores, a saber: qualidade do tecido doado, vascularização da área receptora, imobilização do enxerto e eficiência dos mecanismos de reparo.
Dentre estes fatores, a eficiência dos mecanismos de reparo independe da técnica cirúrgica ou das condições cirúrgicas locais sendo inteiramente dependentes do paciente.
Na década de 80, os grandes laboratórios de pesquisa procuraram investigar a possibilidade da utilização de mediadores químicos na modulação do processo de reparo dos enxertos ósseos.
Muitos fatores de crescimento foram identificados, isolados, e testados quanto a sua capacidade de iniciar o crescimento ósseo.
Os fatores de crescimento agem nas células osteoprogenitoras diferenciando-as e auxiliando o trabalho das células presentes no osso pré-existente. Desta forma, nos defeitos ósseos maiores onde as células ósseas remanescentes não são suficientes para induzir o reparo, os fatores de crescimento desempenham um papel fundamental.
Composto por um grupo de polipeptídios os fatores de crescimento formam um grupo de mediadores biológicos que regulam eventos celulares importantes no reparo dos tecidos, proliferação de células incluindo, diferenciação, quimiotaxia e formação de matriz.
Muitos estudos em vivo e em de vitro avaliaram os efeitos destes polipeptídios na formação de osso. Fatores de crescimento e fatores de diferenciação achados nos ossos incluem PDGF, TGF, fator de crescimento de fibroblastos básico (FGF), IGF, e BMPs.
Estes fatores são produzidos por diversas células entre elas, plaquetas, fibroblastos, osteoblastos, condroblastos e outras células de natureza mesenquimal. (Lynch14, 1991)
Em 1991, Lynch14. demonstrou o uso de Plasma Rico em Plaquetas obtendo resultados encorajadores quanto à reparação do tecido ósseo. O autor demonstrou que os fatores existentes nas plaquetas são capazes de auxiliar as células ósseas no processo de reparo de lesões ósseas.
Diversos trabalhos se seguiram comprovando, de maneira bastante positiva a possibilidade de utilização de fatores de crescimento em procedimentos cirúrgicos com segurança biológica.
Recentemente surgiram no mercado equipamentos desenvolvidos para a obtenção de Plasma Rico em Plaquetas de forma automática. Estes equipamentos, entretanto, possuem um preço muito elevado o que torna a sua relação de custo/benefício impraticável.
A procura de um protocolo de obtenção de fatores de crescimento que pudesse ser efetuado por qualquer colega em nosso País, sem a necessidade de equipamento sofisticado, motivou e dirigiu o autor na obtenção destes resultados.

Revisão da Literatura

Axhausen1 (1956) descreveu pela primeira vez,de uma maneira clinica e histológica, os fenômenos do processo de reparo ósseo. O autor fez uma retrospectiva histórica do processo e enfocou os principais momentos da reparação.
Friedenstein, et al7. (1979) publicaram um estudo onde enfocavam a resposta dos enxertos ósseos autógenos tomados do osso ilíaco. Os autores descreviam as vantagens e desvantagens de carregar junto com o osso enxertado, as células medulares presentes neste tipo de osso. Baseados em achados clínicos e histológicos os autores concluíram que a osteogênese nestes casos é bastante significativa.
Em 1982, Gray & Elves10 publicaram uma pesquisa experimental utilizando um modelo canino onde discutiam a osteogênese que ocorria nos enxertos de osso esponjoso. Neste trabalho, os autores demonstravam que, as células competentes das áreas doadoras são responsáveis pelo início da osteogênese no reparo deste tipo de enxerto. Estas células estão presentes tanto no osso enxertado como no leito receptor sendo que as duas populações participam do processo de osteogênese.
As variações do gradiente de oxigênio na zona de reparo foi estudada por Knington et al.12 em 1982. Os autores demonstraram que o aumento do gradiente de oxigênio entre o enxerto e o osso adjacente ativa a quimiotaxia dos macrófagos que, por sua vez, estimulam a secreção por parte destas células dos fatores angiogênicos (MDAF). Este processo associado ao PDGF fator de crescimento derivado de plaquetas, inicia rapidamente o processo de angiogênese necessário a sobrevivência do enxerto.
Em 1986, Ross. e Raines27 publicaram um trabalho onde demonstravam o papel biológico dos fatores de crescimento existentes nas plaquetas. O autor descrevia o efeito de iniciar o reparo dos tecidos, tanto moles como duros do organismo.
O uso de fatores de crescimento foi tentado inicialmente por Lynch et al14. (1991). Os autores utilizaram o plasma rico em plaquetas e o fator semelhante a insulina em defeitos ósseos periodontais, circumferenciais.
Neste trabalho, os autores encontraram um excelente crescimento ósseo nos casos tratados quando comparados com os controles.
Ainda em 1991, Lynch et al14. testaram a mesma mistura de fatores de crescimento, desta vez, em defeitos ao redor de implantes. Os resultados foram semelhantes aos encontrados nos defeitos periodontais.
Becher & Lynch (1992)2 publicaram um trabalho onde comparavam a utilização de membranas de Poli - tetrafluor-etileno expandido combinadas com fatores de crescimento derivados do plasma rico em plaquetas e osso desmineralizado. Os autores compararam os resultados com um grupo controle que utilizava somente membranas e coágulo. Os resultados mostraram um crescimento
Marx et al. (1993)16 descreveram as vantagens da utilização de osso autógeno como material de enxertos. Os autores acreditam que por possuir células osteocompetentes e todos os fatores de crescimento inerentes ao reparo ósseo, este tecido deveria ser o de eleição nos enxertos de aposição comuns as reconstruções maxilares e mandibulares.
Em 1994, Marx et al17 publicaram um outro trabalho onde apresentavam dados clínicos e histológicos mostrando a capacidade de reparo inerente ao osso autógeno. Os autores basearam seus achados em uma grande quantidade de casos de reconstrução de maxilares e mandíbulas de pacientes que sofreram ressecções causadas por neoplasias.
Com relação ao papel dos fatores de crescimento existentes no tecido ósseo, Giannobile et al9. (1994) demonstraram em um modelo que utilizava primatas, o potencial osteoindutor do PDGF associado do IGF-I. Estes fatores adicionados a lesões periodontais dos primatas mostraram um crescimento ósseo 21,6% maior nos animais tratados em relação aos controles.
Caplan3 (1995) publicou um trabalho onde estudava os fatores indutores do processo de reparo ósseo. O autor associou o início do reparo ósseo aos fatores derivados das plaquetas e dos macrófagos atribuindo as fases tardias aos fatores liberados pelos osteoblastos no processo de formação óssea.
Cook & Rueger6 (1996) apresentaram um novo fator de crescimento isolado denominado Proteína osteogênica 1. O efeito osteocondutor desta proteína foi demonstrado pelos autores que atribuíram a ela a formação de osso novo e a promoção de crescimento de osteoblastos.
Os autores acreditam que este fator está centralmente envolvido no processo de reparo ósseo.
Robert Marx et al.18 (1998) apresentaram a utilização do Plasma Rico em Plaquetas como solução na utilização segura de fatores de crescimento em enxertos ósseos.
Os autores demonstraram a utilização clínica de fatores existentes no PRP associados a enxertos de osso desmineralizado. O crescimento ósseo obtido era muito superior ao encontrado nos controles.
Ainda em 1998, Reddi24 afirmou que a utilização dos fatores plaquetarios existentes no Plasma Rico em Plaquetas era segura e efetiva.
Finalmente, em 1999, Garg8 publicou uma pesquisa clinica onde mostrava o futuro da utilização dos fatores de crescimento nos enxertos maxilares. O autor afirmava que o Plasma Rico em Plaquetas era seguro e efetivo enquanto o uso das BMPs possuía limitações técnicas.

Materiais e Métodos

Materiais:

Grupo de trabalho: Utilizou-se para o presente estudo cães da raça Beagle, provenientes de canil especializado em animais experimentais (UNITOX - UNISA) em número de 4, machos e fêmeas adultos. Os cães foram mantidos em dieta regular e água ad-libitum em canis individuais sob observação veterinária constante.
Material de coleta: Para a coleta de sangue dos animais utilizou-se tubos de vácuo (Vacuotanerâ) de 4,5ml contendo citrato de sódio (anticoagulante). (Figura 1)


Fig.1 - Tubo de Cirtrato de sódio

Centrífuga: Para o tratamento das amostras utilizou-se uma centrífuga Fanem 260 mp, de 8 x 15 ml , microprocessada com tubos para calibragem. ( Figura 2)


Fig.2 Centrífuga

Método:

Coleta de sangue: Procedeu-se a coleta de sangue da veia jugular dos cães, sob sedação, sendo colhidos 3 tubos de 4,5ml de cada cão. (Figura 3)


Fig.3 - Sangue colhido do cão

Os tubos foram homogeneizados em aparelho adequado e enviados para processamento.
Obtenção do P.R.P. : Os tubos de citrato foram centrifugados a 750 rpm por 10 minutos o que equivale a 2g .
O P.R.P. foi então pipetado e acondicionado em um tubo de 15 ml. Desta maneira pode-se obter aproximadamente 1,5ml de P.R.P. em cada tubo totalizando aproximadamente 3,0 ml. A seguir, 1,0 ml da zona de névoa é pipetado e guardado me outro tubo. Esta porção possui plaquetas mais velhas e hemáceas que serão utilizadas na confecção do gel de plaquetas. ( Figura 4)


Fig. 4 - P.R.P. sendo pipetado

Checagem do P.R.P.: Um esfregaço do PRP obtido foi corado pelo método de Geimbsa e examinado ao microscópio óptico para contagem do número de plaquetas. Considera-se positivo um P.R.P. que apresente no mínimo 1.000.000 de plaquetas por ml.
Promoção do Gel de P.R.P. : Para a promoção do gel do plasma rico em plaquetas adicionou-se ao PRP obtido (1,5ml) 1 ml de uma solução de cloreto de cálcio a 10% ( 10 ml) e trombina bovina tópica (10.000 UI). Após 10 segundos de agitação o coágulo foi obtido. (Figura 5).


Fig. 5 - Trombina e Cloreto de cálcio

Resultados

Em todos as amostras de PRP obtidas pelo protocolo proposto, encontrou-se valores entre 1.000.000 e 1.200.000 plaquetas por ml o que confirma a positividade do plasma obtido.
O gel de P.R.P. foi obtido de todas as amostras sem nenhum problema.

Discussão

A reconstrução dos maxilares é única comparada com a dos outros ossos por causa das diferentes demandas destas estruturas em função. Ao contrário dos ossos longos do corpo, um maxilar reconstruído deve suportar as forças de cisalhamento ao invés das forças de compressão, e ser capaz de suportar implantes e próteses dentais ao invés do peso produzido. Para assegurar a própria função, os enxertos devem satisfazer exatamente as especificações com relação ao tamanho, forma, angulação, e coordenação com o maxilar oposto.
O modo mais comum e previsível de se conseguir estes objetivos com o mínimo de morbidade é através do uso de enxertos de osso esponjoso (Marx16 1993). Os enxertos dos ossos do crânio podem ser usados em locais designados como enxertos onlay para reconstruir a forma da maxila. A reconstrução pode ser acompanhada por uma combinação de três mecanismos fisiológicos: osteogênese, que é o desenvolvimento de osso novo a partir de células osteocompetentes; osteocondução, por meio da qual as células formadoras de osso se originam das células osteocompetentes do leito hospedeiro pré-existente formando novo osso ao longo de um patamar de uma substância aloplástica ou biológica; e osseoindução, na qual é formado novo osso por diferenciação e estimulação de células mesenquimais por proteínas ósseas indutivas (Marx171994).
Existem muitos meios confiáveis, disponíveis para os profissionais atuais, para aumentar uma mandíbula severamente atrófica, mas a restauração de uma maxila totalmente atrófica continua a representar um problema protético comum.

Modelo de Reparação Óssea

As células osteocompetentes das áreas doadoras de osso tanto do ilíaco como do platô da tíbia compreendem osteoblastos a população de células de base medular esponjosa (Axhausen1 1956; Gray & Elves10 1982; Friedenstein e cols7 1979; Caplan3 1995). O próprio enxerto contém células osteocompetentes e ilhas de osso esponjoso mineralizado, coágulo sanguíneo e fibrina, e plaquetas dentro do coágulo. Os osteoblastos endósteos e as células da base medular sobrevivem bem nos três a cinco dias iniciais por causa da sua posição superficial e sua habilidade de absorver nutrientes dos tecidos receptores. Os osteócitos dentro do osso esponjoso mineralizado morrem devido ao seu revestimento mineralizado que serve como uma barreira nutricional. O aumento do gradiente de oxigênio entre o enxerto e o tecido adjacente ativa a quimiotaxia dos macrófagos que, por sua vez, estimula os macrófagos a secretarem o fator de angiogênese derivado do macrófago (MDAF) e o fator de crescimento derivado do macrófago (MDGF). Dentro do enxerto, as plaquetas se enredam na degranulação do coágulo dentro de algumas horas da colocação do enxerto, liberando o fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF). Então, as propriedades inerentes da ferida (particularmente o gradiente de oxigênio e o PDGF) iniciam rapidamente a angiogênese dos capilares adjacentes e a mitogênese das células osteocompetentes transferidas (Knignton et al12 1988). Por volta do 3o- dia, podem ser vistos capilares brotando dos capilares existentes do lado externo do enxerto. Eles penetram o enxerto e se proliferam na rede de osso esponjoso para formar uma rede completa por volta do 10o- ao 14o- dia. Como estes capilares respondem pelo gradiente de oxigênio, eles efetivamente reduzem o gradiente de oxigênio quando perfundem o enxerto, assim criando um mecanismo de fechamento para prevenir uma angiogênese excessiva (Knighton et al.12 1988). Embora o PDGF pareça ser o mensageiro mais adiantado para estimular a formação precoce do osteóide, isto é provavelmente substituído pelo MDGF e outros estimuladores do tecido mesenquimal da família do fator beta de crescimento em transformação (TGF-b). Durante o 3o- e o 7o- dias iniciais, a população das células de base e os osteoblastos endósteos produzem somente uma pequena quantidade de osteóide. Porém, desde que a rede vascular seja estabelecida, a produção de osteóide acelera, provavelmente devido ao oxigênio e nutrientes avaliáveis. A formação inicial do osteóide se desenvolve na superfície da trabécula esponjosa mineralizada dos osteoblastos endósteos. Logo depois, ilhas individuais de osteóide se desenvolvem entre as trabéculas do osso esponjoso, provavelmente das células de base transferidas para o enxerto. Uma terceira fonte de produção de osteóide se desenvolve das células de base circulantes que são também atraídas para o meio bioquímico da ferida (Caplan3 1995). Acredita-se que estas células de base se inoculam dentro do enxerto, onde se proliferam e contribuem para a produção do osteóide.
Durante a 3a- e 4a- semanas iniciais, esta fase celular e bioquímica da regeneração óssea procede para a consolidação clínica do enxerto pela coalescência das ilhas de osteóides, dos osteóides da superfície das trabéculas esponjosas, e do osso hospedeiro. Este processo, que usa a rede de fibrina do enxerto como uma armação, é usualmente referido como uma osteocondução que provê um patamar chamado de "substituição rastejante", mas o sensato seria "formação rastejante". Isto é para dizer que, normalmente as células não móveis (como os osteoblastos) podem ter até certo ponto mobilidade pelo processo de endocitose ao longo da fibrina como um patamar. O processo de endocitose é simplesmente a transferência da membrana celular pela borda retirada da célula através do citoplasma através de uma vesícula que avança a borda para corrigir a membrana celular. Este mecanismo lentamente avança a célula e permite a secreção de seu produto no processo. Neste caso, o produto é o osteóide sobre a rede de fibrina. Esta regeneração celular é freqüentemente referida como regeneração óssea Fase I (Axhausen1 1956). Com o tempo fica quase completo (4 a 6 semanas ), tendo ocorrido suficiente produção e mineralização do osteóide para permitir a função do enxerto. Neste estágio, o osso formado sem a fase condroblástica, parece histologicamente com um osso com células sem um padrão. (Marx17 1994)".
Desde que a quantidade de osso formado durante a Fase I depende da densidade das células osteocompetentes, áreas doadoras com mais osso trabecular esponjoso devem ser escolhidas. Em ordem de grau, nós encontramos ilíaco posterior e anterior, platô da tíbia, cabeça do fêmur, e sínfise mandibular para serem áreas doadoras em potencial com áreas maiores de osso esponjoso do que o calvário, costela ou fíbula (Marx16 1993). Alem disto, o aumento da produção óssea da Fase I pode também ser conseguida pela compactação do material do enxerto. Tecnicamente, isto é conseguido com um triturador de osso, seguido por uma compactação em uma seringa, e então compactado também dentro do local do enxerto usando os instrumentos de preenchimento ósseo. A regeneração das células ósseas que ocorrem na Fase I produz um osso não lamelar desorganizado que é estruturalmente sadio, mas não a ponto de um osso maduro. A organização aleatória e a natureza hipercelular deste osso são similares para aquele visto em um calo de fratura. Este osso sofrerá uma reabsorção obrigatoriamente e a substituição pela remodelação. Eventualmente, é substituído pelo osso da Fase II que é menos celular, mais mineralizado, e estruturalmente mais organizado (Axhausen1 1956; Marx17 1994). A teoria é que estes osteoclastos reabsorvem o osso da Fase I em um ciclo normal de remodelação e substituição. Tanto no osso da Fase I como no osso trabecular esponjoso original não viável que são reabsorvido, o BMP é liberado. Assim com o turnover normal do osso, o BMP age como uma união ou uma dupla entre a reabsorção óssea e a aposição de novo osso. As células de base no enxerto da transplantação original e as novas células que chegam dos tecidos locais e da circulação respondem pela diferenciação osteoblástica e a formação de novo osso.
Este novo osso se forma assim que os maxilares e os enxertos estão em função. Ele responde às demandas recebidas e desenvolve sistemas harvesianos maduros e osso lamelar capaz de resistirem às forças normais de cisalhamento recebidas nos maxilares através das funções de abertura e fechamento. Histologicamente, tais enxertos introduzem em longo prazo uma consistente remodelação com turnover esqueletal normal. Um periósteo e um endósteo se desenvolvem com parte desta remodelação em longo prazo. A cortical do enxerto nunca se forma tão fina quanto à do maxilar e o enxerto por si só mantém um padrão trabecular esponjoso denso. Este padrão é muito vantajoso para se promover a osseointegração e é muito adaptável a uma variedade de estresses funcionais. Após vários anos, o enxerto toma a morfologia radiográfica de contornos corticais de uma mandíbula ou maxila.

Fatores de crescimento e Morfogênese

Os fatores de crescimento agem nas células osteoprogenitoras diferenciando-as e auxiliando o trabalho das células presentes no osso pré-existente. Desta forma, nos defeitos ósseos maiores onde as células ósseas remanescentes não são suficientes para induzir o reparo, os fatores de crescimento desempenham um papel fundamental.
Composto por um grupo de polipeptídios os fatores de crescimento formam um grupo de mediadores biológicos que regulam eventos celulares importantes no reparo dos tecidos, proliferação de células incluindo, diferenciação, quimiotaxia e formação de matriz.
Muitos estudos em vivo e em de vitro avaliaram os efeitos destes polipeptídios na formação de osso. Fatores de crescimento e fatores de diferenciação achados nos ossos incluem PDGF, TGF, fator de crescimento de fibroblastos básico (FGF), IGF, e BMPs.
A matriz extracelular do osso é um reservatório multifatorial para os fatores de crescimento que regulam a função das células do osso. Os fatores de crescimento encontrados na matriz de extracelular do osso são mediadores moleculares potenciais de diferenciação, manutenção, e reparação óssea.(Ripamonti26 1992)

Fator de Crescimento semelhante à Insulina

IGF-I e IGF-II são encontrados em grandes quantidades no tecido ósseo.Na matriz de osso, IGF-II é o fator de crescimento mais abundante.
Produzido por osteoblastos, IGF-I estimula a formação de osso por proliferação celular induzindo, diferenciação, e induz a biosíntese do colágeno. Altas quantidades de IGF-I são sintetizadas por osteoblastos na formação do tecido ósseo. (Lynch 1991)
Os efeitos in vitro (ex., promovendo quimiotaxia de osteoblastos) de IGF-I e IGF-II são semelhantes. Porém, foi achado que IGF-II não é tão potente quanto IGF-I no processo de formação de osso. Foi encontrado, entretanto que a combinação de IGF-eu ou IGF-II e outros fatores de crescimento pode aumentar o processo de ossificação no reparo. (Lynch14 1991)
Outro estudo efetuado por Lynch et al14 avaliou a habilidade da combinação de PDGF-B/IGF-I em vivo de promover regeneração de osso ao redor de implantes. Resultados mostraram que aos 7 dias, os implante, tratados com a combinação de fator de crescimento tiveram uma maior porcentagem de contato de osso-implante que os implantes tratados com placebo ou implantes não tratados. Este achado sugere que integração mais rápida pode acontecer com o uso de PDGF-B e IGF-I. Isto é um achado importante porque a imobilidade do implante durante as fases iniciais do reparo é importante para a estabilidade secundária do implante e assegurar sucesso de tratamento.
Fator de Crescimento de Fibroblastos
São achados FGF ácido e básico na matriz do tecido ósseo. Ambas as formas de FGF estimulam a síntese de DNA e replicação de células em vitro, mas eles diminuem a atividade de fosfatase alcalina e não tem nenhum efeito estimulador direto em osteoblastos maduros. Ambos os tipos de FGF são estimulantes potentes de angiogênese o que é importante para a invasão vascular do enxerto. (Lynch14 1991)
Fator-b transformandor
O termo TGF-b se refere a superfamília de fatores de crescimento e diferenciação que incluem BMPs. TGF-b1 e TGF-b2 que são sintetizados e encontrados em plaquetas, macrófagos, e alguns outros tipos de células. O TGF-b1 e o TGF-b2 afetam fibroblastos, células mesenquimais indiferenciadas, principalmente pré-osteoblastos depois de sua secreção pelas plaquetas degranuladas ou ativamente secretados através de macrófagos. Os TGF-b1 e TGF-b2 atuam nos mecanismos de reparo em longo prazo, e com o passar do tempo na remodelação do osso produzido. Estes fatores de crescimento têm várias funções importantes, quimiotaxia, incluindo a mitogênese dos precursores dos osteoblastos, e a estimulação de osteoblastos na matriz do colágeno de lesão, reparando o osso. O TGF-b1 e TGF-b2 promovem a formação de osso sobre as zonas de reabsorção inibindo formação de osteoclastos. (Marx18 1998)
Em sistemas em desenvolvimento, o TGF-b é um regulador multifatorial do crescimento celular. O TGF-b é muito abundante na matriz extracelular do osso. O TGF-b estimula na matriz do osso a produção de fibronectina, colágeno, e a biosíntese de osteonectina.Também são expressos genes de TGF-b durante o reparo de fraturas de osso em humanos. Por causa de seu pleiotropismo efetua na formação da matriz do osso a reabsorção, como também por sua abundância relativa no osso, o TGF-b também atua na formação óssea. (Lynch14 1991)
Proteínas Morfogeneticas
Até esta data, foram descobertas e publicadas 12 BMPs na literatura. Onze destas BMPs, BMP-2 a BMP-12, estão relacionadas umas com as outras e são classificadas como pertencendo a superfamília de TGF-b por causa de suas seqüências de aminoácidos. Estas BMPs isoladamente iniciam a formação iniciada de osso endocondral .(Garg8 1999)
Quantidades pequenas de BMP nativo estão presentes em osso cortical (aproximadamente 1 a 2 mg de BMP por quilograma de osso cortical).(Riley25 1996)
Muitos grupos isolaram e identificaram BMPs em outros sistemas, dando outros nomes de referência à estas moléculas. O BMP-3 é também conhecido como osteogenina, e BMP-7 e BMP-8 também são chamados de proteína-1 osteogênica (OP-1) e proteína-2 osteogênica (OP-2), respectivamente. (Reddi24 1996)
Os BMPs são moléculas pleiotrópicas que são envolvidas na quimiotaxia, mitose, e diferenciação de células mesenquimais no tecido ósseo. Depois da quimiotaxia de monócitos e células mesenquimais a diferenciação celular acontece. As células mesenquimais proliferam e diferenciam-se em condrócitos que em seguida hipertrofiam-se. Eles sofrem morte celular e são então substituído por osso. O ambiente criado com a presença do BMPs determina o tipo de tecido produzido. Em um local heterotópico, o BMP-3 ou BMP-7 produzem cartilagem. No periodonto, eles produzem cemento, ligamento periodontal, e osso alveolar. Em áreas craniofaciais o BMP-3 e BMP-7 produzem o osso intramembranoso. (Reddi24 1996)
BMP Bovino
Um estudo de BMP bovino em um modelo de cães mostrou que sua aplicação aumentou a taxa de osseointegração ao redor de implantes após 4 semanas. Achados em SEM mostraram formação abundante de osso lamelar ao redor dos implantes cobertos com BMP bovino, 8 semanas após a sua administração.(Lynch14 1991)
Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas
PDGF é o primeiro fator de crescimento a aparecer em uma ferida. Isto inicia o processo de reparo do tecido conjuntivo, inclusive a regeneração de osso. No momento do dano, o PDGF emerge das plaquetas que degranulam ativando os receptores de membrana de células designadas (alvo). Estas células designadas desenvolvem laços de fosfato de alto-energia com proteínas internas do citoplasma as quais ativam então os laços para iniciar uma atividade específica dentro da célula designada.O PDGF tem várias atividades importantes, específicas: (1) aumento o número de células reparadoras, mitoses de endoteliócitos em vasos capilares locais, debridamento do local da ferida, e são uma fonte de fatores para crescimento e regeneração de osso continuada. (Marx 181998)
O PDGF estimula a síntese de DNA, quimiotaxia, colágeno e síntese de proteína de não-colágeno em cultura de osso. O PDGF regula atividade da fosfatase alcalina e da osteocalcina.
O Plasma rico em Plaquetas é uma fonte de autóloga de PDGF e TGF-b. É obtido isolando e concentrando plaquetas usando centrifugação.(Garg8 1999)
O Plasma rico em Plaquetas somado a enxertos de osso resulta em uma taxa de maturação 1.62 a 2.16 maior que enxertos de osso que não receberam o plasma, mostrando uma maior quantidade e densidade de osso. (Marx18 1998)

Plasma Rico em Plaquetas: Fator de Crescimento para Enxertos Ósseos A bioquímica do tecido receptor e do próprio enxerto, como anteriormente explicado, é altamente intrigante. Porém, atualmente, estudos e experiências com o plasma rico em plaquetas (PRP) adicionado ao enxerto têm mostrado uma consolidação mais rápida e uma mineralização do enxerto na metade do tempo além de uma melhora de 15% a 30% na densidade do osso trabecular (Marx et al18. 1998)
O conceito é que o PRP, que é um coágulo de fibrina (às vezes referido como uma cola de fibrina), é rico em plaquetas as quais liberam, em períodos cíclicos, PDGF e TGF-b.
O PDGF parece ser o primeiro fator de crescimento presente em uma ferida e inicia a reparação do tecido conjuntivo, incluindo regeneração e reparo ósseo. As atividades específicas mais importantes do PDGF incluem mitogênese (aumento da população de células, principalmente das células de reparação), angiogênese (mitose endotelial dentro de capilares em função), e atividades de macrófagos (debridamento do local da ferida e origem da segunda fase dos fatores de crescimento para o reparo continuado e regeneração óssea) (Ross et al27 1988)
Há aproximadamente 0.06 ng de PDGF por milhão de plaquetas ou cerca de 1,200 de moléculas de PDGF por plaqueta, demonstrando o grande potencial destas .
A teoria é que isto aumenta a quantidade inicial de PDGF o que propicia uma maior atividade da célula osteocompetente de forma mais completa do que quando ocorre no enxerto e no meio do coágulo apenas (Ross et al 271988 ). Além disto, acredita-se que o aumento da rede de fibrina criado pelo PRP aumenta a osteocondução do início ao fim da consolidação do enxerto. O TGF-b é um termo aplicado para uma "super" família de fatores de crescimento e de diferenciação, das quais os últimos 13 BMPs descritos são membros (Celeste et al. 1990). As proteínas TGF-b1 e TGF-b2 são os fatores de crescimento mais protéicos e genéricos envolvidos com o reparo do tecido conjuntivo em geral e regeneração óssea.
Estas proteínas TGF-b representam um mecanismo que mantém o módulo de regeneração óssea e a reparação em longo prazo e se transformam em um fator de remodelação óssea com o tempo. A função mais importante do TGF-b1 e do TGF-b2 parece ser a quimiotaxia e a mitogênese dos precursores de osteoblastos e sua habilidade para estimular sua deposição da matriz de colágeno na reparação da ferida e do osso (Marx17 1994). Além disto, as duas proteínas TGF inibem a formação de osteoclastos e a reabsorção de osso, assim, favorecendo mais formação do que reabsorção pelos dois mecanismos diferentes.
Um modelo razoável tem sido desenvolvido para regeneração óssea em enxertos celulares da medula esponjosa baseado em trabalhos anteriores e em conhecimentos recentes. (Marx et al.18 1998) Este modelo também aponta para dois fatores fundamentais que influenciam a regeneração óssea normalmente e mostram, como as quantidades aumentadas de cada um através do PRP produzem uma taxa mais rápida de formação óssea e uma quantidade maior de osso. A amplificação da influência do PDGF e do TGF-b através da técnica de seqüestro e concentração de plaquetas no PRP é vista como uma ferramenta disponível e prática para aumentar a taxa de formação óssea e a quantidade de osso formado.

Protocolo Simplificado de Obtenção de PRP

O autor, através da experimentação de diversos diâmetros de centrífugas, utilizadas nas rotações preconizadas para a obtenção de "papa de plaquetas" para uso em pacientes portadores de distúrbios de coagulação, logrou uma relação adequada a necessidade volumétrica de PRP para a utilização clínica. Desta maneira é possível reproduzir de maneira precisa o protocolo proposto utilizando uma simples centrífuga de laboratório biomédico de 8 x 15 ml ( ex: FANEN 260 mp de 8 x 15 ml)
O Plasma Rico em Plaquetas é obtido a partir do seguinte protocolo:
1 - Através de punção venosa periférica, sangue venoso é obtido na quantidade de aproximadamente 15 ml, colhidos em 3 tubos de vácuo contendo citrato de sódio de 4,5 ml.
2 - Os tubos são centrifugados em uma centrifuga de 8 x 15 ml a 2 gravidades ( equivalente a 700 - 800 rpm por 10 minutos).
3 - A porção celular (leucócitos e hemáceas) precipita na porção final do tubo e o plasma rico sobrenada.
4 - O PRP é pipetado diretamente dos tubos e acondicionado em um tubo único. Pipetamos 1ml da "zona de névoa" e reservamos em outro tubo. Esta suspensão será utilizada juntamente com o PRP para a obtenção do coágulo pois contem hemáceas e plaquetas maiores.
Desta maneira podemos obter um volume de 1,0 ml de PRP autógeno por cada tubo em um total de 3 ml. No momento da utilização o PRP é mesclado ao enxerto e adicionado com 1 ml do tubo com as células maiores e hemáceas, bem como a solução de trombina bovina e cloreto de cálcio para obtermos a coagulação.
O fato do PRP ser um preparado autólogo elimina as influências de transmissão de doenças ou reações imunogênicas que existe com preparadosalogênicos ou xenogênicos. Por isso o PRP é preparado no ato da cirurgia, a possibilidade da rotulação errada de uma amostra (que pode ocorrer quando usamos um sistema laboratorial) é também eliminada.
O mecanismo relativamente "bruto" de acréscimos de aditivos bioquímicos na ferida pode ser um precursor do futuro, mais sofisticado e com mais possibilidades.
Os clínicos e pesquisadores estão atualmente procurando a disponibilidade clínica do DNA recombinante produzido pelo BMP. Estudos com animais e experiências recentes com humanos indicam que o BMP (em um suporte reabsorvível apropriado) tem a capacidade de produzir osso fisiologicamente normal, a qual pode eliminar a necessidade do enxerto ósseo no futuro próximo (Marx16 1993). A dificuldade destes modelos reside, entretanto na obtenção de um protocolo confiável para reprodução clínica dos resultados experimentais.

Conclusão

1 - Os fatores de crescimento ósseo são fundamentais no reparo dos enxertos ósseos. O uso destes fatores de crescimento têm muitas vantagens, inclusive redução do tempo necessário para formação de osso novo bem como aumento do trabeculado obtido no reparo.
2 - O Plasma Rico em Plaquetas obtido de forma autógena pelo protocolo simplificado proposto pelo autor é um auxiliar importante e seguro nas cirurgias de enxertos maxilares.

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