Alessandro A. Costa Pereira

Clóvis Marzola

Jesus Carlos Andreo

João Lopes Toledo Filho

Leonardo de Lavalle Restrepo

Na presente pesquisa avaliou-se microscopicamente o potencial do Osseobond (matriz óssea bovina desmineralizada) + membrana reabsorvível do osso bovino (Dentoflex "www.dentoflex.com.br") no reparo de defeitos ósseos provocados em tíbias de ratos "Wistar albinus". Um total de 40 defeitos ósseos de aproximadamente 3 mm de diâmetro foram produzidos com broca de fissura 701 nas tíbias direita e esquerda dos animais. Em cada animal um defeito foi preenchido com partículas de Osseobond mescladas com aglutinante "Dentoflex" e, recoberto com membrana reabsorvível de osso bovino liofilizado "Dentoflex". A outra falha foi preenchida com coágulo sangüíneo do próprio animal. Os animais foram sacrificados após 3, 7, 10, 20 e 40 dias. As peças descalcificadas foram processadas e cortes histológicos foram obtidos. A analise histológica indicou que no grupo controle e experimental aos 7 dias, foram encontradas áreas iniciais de neo-formação óssea na periferia das lojas cirúrgicas com grande quantidade de osteoblastos e tecido osteóide. Nos grupos controle de 10, 20 e 40 dias o padrão de neo-formação óssea manteve-se uniforme, culminando com o preenchimento da loja cirúrgica já a partir do período de 20 dias. No grupo experimental de 20 dias a formação óssea teve seu início junto à cortical oposta, da periferia para o centro preenchendo parcialmente a loja cirúrgica. No grupo experimental de 40 dias as lojas cirúrgicas encontravam-se praticamente reparadas com tecido ósseo pouco trabeculado, com a formação óssea preenchendo a loja cirúrgica, contudo, não ultrapassado seu limite externo.

Estudo Microscópico em Tíbia de Ratos (Wistar albinus) 

INTRODUÇÃO

É preocupação do cirurgião dentista a perda óssea ocorrida logo após a extração de dentes, assim como a formação de tecido fibroso onde deveria existir tecido ósseo, limitando a grande maioria dos casos clínicos à perfeita adaptação de próteses futuramente, vindo a restringir a função estomatológica do paciente e impedindo sua recuperação estética. Por isto desde algum tempo pesquisas estão evoluindo no sentido de possibilitar a colocação de materiais no interior de cavidades ósseas após exodontias, exéreses de cistos, apicoplastias ou ainda de outras patologias onde possa vir a ocorrer uma loja óssea após o procedimento cirúrgico.      

Estas cavidades em condições normais, desde que o agente causador tenha sido eliminado, são reparadas através de processo de reparo biológico natural. A extensão e velocidade deste processo de reparação, está na dependência da localização anatômica do agente etiológico, das dimensões da lesão, além das características biológicas de cada indivíduo. Podem ser necessários anos para se completar um reparo, expondo-se o paciente a riscos e desconfortos, muitas vezes desnecessários .       

Na tentativa de reconstrução total ou parcial dessas estruturas perdidas, desenvolveram-se técnicas com o objetivo de recuperar o contorno anatômico normal, restaurar sua função, eliminar espaços mortos, favorecer a cicatrização, além de prevenir a invaginação de tecidos moles para o interior dessas cavidades, reduzindo assim as chances de infeções secundárias e, restabelecendo conseqüentemente, de maneira quase imediata o suporte para aparelhos protéticos .        

Materiais implantares em cavidades ósseas como o gesso paris, osso sintético e osso anorgânico, foram utilizados com resultados relativamente apreciáveis . A idéia de ser usado osso desmineralizado em defeitos ósseos não é nova e, já em 1889 SENN relatava o uso desse material para tratamento de falhas ósseas ocasionadas por osteomielites. Uma alternativa viável no tratamento de lesões ósseas crânio-bucofaciais vem sendo a utilização de matriz óssea alogênica desmineralizada submetida a procedimentos especiais de reparo, para o preenchimento do espaço das lesões, na expectativa de formação de novo osso na região .    

O comprometimento do reparo ósseo ocorre pela união fibrosa no defeito ósseo, pela invasão de fibroblastos no coágulo sangüíneo. Para que isto seja evitado, pode-se lançar mão de uma técnica cirúrgica que impeça que o coágulo sangüíneo, ou a loja óssea, sejam populados por células indesejáveis, pela colocação de membranas ou barreiras físicas, favorecendo assim a migração de células com potencial osteogênico. Assim, impede-se que os fibroblastos colonizem o coágulo antes dos osteoblastos, que são mais lentos em sua função.        

A utilização de membranas biológicas impede que as células do epitélio bucal e do tecido conjuntivo participem da cicatrização do defeito ósseo, deixando que as células osteoblásticas tenham a prioridade de se conduzirem para a área. Estas membranas criam um meio propício para melhorar a regeneração funcional através do potencial biológico natural que inclui fatores como a prevenção da inflamação conseqüente à presença bacteriana, a estabilidade mecânica do coágulo, a criação e manutenção do espaço pôr ele preenchido além do isolamento dos tecidos indesejáveis do local de regeneração.        

As formou osso de alta qualidade e os 8 implantes colocados encontravam-se osteointegrados na época da segunda cirurgia. O osso liofilizado além de formar osso em menor quantidade, mostrou também ser de má qualidade.        

Considerando-se as cirurgias periapicais, apicoplastias, exérese de cistos, intervenções nos tecidos do periodonto, e levando-se em conta os conceitos biológicos da Regeneração Tecidual Guiada (RTG), propusemo-nos a realizar uma análise experimental da utilização de membrana biológica de osso bovino recobrindo cavidades ósseas preenchidas com matriz de osso bovino liofilizado (OSSEOBOND), sendo ambos materiais fabricados pelo Departamento de Bioquímica da FOB-USP.    

MATERIAL E MÉTODOS        

Foram utilizados 20 ratos machos "Wistar albinus" adultos pesando aproximadamente 250 g provenientes do biotério da FOB-USP. Foram divididos em 5 grupos de 4 animais cada, de acordo com os períodos experimentais de 3, 7, 10, 20 e 40 dias. As cirurgias foram realizadas com os animais sob anestesia por inalação com éter sulfúrico.        

Após anestesia e preparado o campo cirúrgico foi efetuada tricotomia das regiões ventral direita e esquerda das superfícies laterais das tíbias com lâmina de barbear e assepsia vigorosa com iodo tópico. Foram incisadas com lâmina de bisturi número 15, a pele e a fascia muscular em seu sentido longitudinal, com aproximadamente 1,5 cm de extensão, para expor-se a superfície anterior do osso. Em seguida outra incisão foi praticada sobre o periósteo para permitir seu descolamento, sendo afastado no sentido posterior, obtendo-se assim, excelente área de trabalho (Fig.1). Duas pinças foram colocadas para a manutenção e proteção das estruturas moles (Fig.1), uma em cada extremidade óssea realizando-se as cavidades na tíbia, com o auxilio de uma broca de fissura número 701 em turbina de alta rotação. Estas cavidades foram preparadas nas superfícies laterais das tíbias direita e esquerda, com aproximadamente 3 mm de extensão longitudinal, e 2 mm de extensão transversal; somente às expensas da cortical óssea lateral e espaço medular das tíbias, sem qualquer envolvimento cortical medial (Fig.1). Assim tornou-se possível a inclusão de materiais implantares, sem exceder o volume da cavidade.   

Foi implantado na cavidade feita na tíbia direita o osso bovino liofilizado da marca Osseobond* que trata-se de uma matriz orgânica de osso cortical bovino na forma microgranulada, obtida por desmineralização cuidadosa e controlada da cortical óssea, finamente pulverizado, misturado com aglutinante Dentoflex* que é um polissacarídeo constituido por glicose com solução tampão com pH fisiológico, cujo componente principal é a Dextrana; e, recobrindo esses materiais, foi colocada uma membrana reabsorvível de osso bovino Dentoflex* produzida a partir da laminação da cortical óssea bovina desmineralizada e liofilizada, umedecida em soro fisiológico a 0.9%, sendo chamada esta de "tíbia experimental" (Fig. 2 e 3). Na tíbia esquerda não foi colocado nenhum material, sendo chamada de "tíbia controle". Logo após ser colocado o material implantar foi estimulado o sangramento da região, sendo reposicionados os tecidos sobre o local, promovendo-se a sutura num só plano, com pontos simples interrompidos com fio de seda preta 4-0 (Ethicon _ Johnson & Johnson) (Fig. 4).    

Terminadas as suturas os ratos foram colocados em gaiolas plásticas com pó de serragem onde permaneceram até o dia do sacrifício, sendo este pó de serragem trocado a cada dois dias. Os animais foram alimentados com rações de alimentos especial PurinaÒ e água corrente em quantidades não especificadas, sendo a água trocada todos os dias.        

Não foi feita nenhuma medicação analgésica, antinflamatória ou antibiótica no pós operatório imediato ou tardio.        

Os 5 grupos foram sacrificados conforme as datas pré-estabelecidas para cada grupo em 3, 7, 10, 20 e 40 dias após a cirurgia, pela intoxicação com éter sulfúrico. Quando do sacrifício, a porção das tíbias contendo a cavidade simples e com material, foi removida, preservando-se o periósteo. Estas porções das tíbias foram removidas usando-se discos de carborundo montados em alta rotação, com irrigação abundante com soro fisiológico à 0.9%.        

As peças foram fixadas em formalina à 10% e descalcificadas em ácido diaminotricloroacético por 30 a 40 dias, desidratadas e incluídas em parafina para posteriores cortes histológicos de 6 a 8 mm semiseriados de 1:5. Estes cortes foram corados por hematoxilina e eosina, sendo as lâminas confeccionadas e analisadas sob microscopia óptica.    

RESULTADOS

Grupo experimental de 03 dias:

Nas lâminas deste grupo observam-se fragmentos de tíbia óssea, com tecido medular interposto por corticais ósseas revestidas parcialmente pelo periósteo. A medula óssea, à distância da loja cirúrgica, mostra padrões de normalidade e hematopoiese. As corticais exibem poucos e estreitos espaços medulares, bem como pequeno número de osteócitos, que estão ausentes na faixa da cortical junto à loja cirúrgica. Em uma das corticais ósseas pode-se notar a loja cirúrgica de forma ovalada, alcançando levemente a cortical oposta, e no interior desta loja observam-se fragmentos de tecido amorfo acelular e eosinófilo, compatível com tecido ósseo desvitalizado. De permeio a esses fragmentos teciduais notam-se grandes quantidades de vasos sangüíneos congestos, hiperêmicos e dilatados, além de focos hemorrágicos e infiltrado inflamatório contendo células mono e polimorfonucleares. Há discretas unidades de reabsorção óssea instaladas junto à loja cirúrgica, tanto no osso cortical, quanto junto nos fragmentos teciduais. Recobrindo a loja cirúrgica nota-se rico exsudado serofibrinoso, com infiltrado inflamatório predominantemente polimorfonuclear além de áreas hemorrágicas. No interior da medula óssea e próximo à loja cirúrgica observam-se, em pequeno número, células gigantes multinucleadas, além de células inflamatórias PMNs e, grande número de vasos sangüíneos (Fig. 5).

Grupo experimental de 7 dias:        

Neste grupo experimental os fragmentos de tíbia mostram, junto à cortical óssea seccionada, áreas de neo-formação óssea, iniciando na periferia da cortical, com um contorno arredondado, acompanhando a loja cirúrgica e unindo-se, ao centro, à neo-formação óssea iniciada na outra cortical. A neo-formação óssea preenche parcialmente a loja cirúrgica na sua periferia e profundamente. Este tecido ósseo neoformado, do tipo imaturo, mostra-se bem celularizado, com muitos osteócitos e revestimento externo por osteoblastos, possuindo arranjo trabecular. No interior da loja cirúrgica notam-se fragmentos de tecido amorfo, acelular, lembrando tecido ósseo desvitalizado, com focos de reabsorção e presença de clastos multinucleados, em lacunas e justapostos à superfície. Externamente, a loja cirúrgica mostra-se com infiltrado inflamatório MN e presença de CGMIs, vasos sangüíneos congestos e hiperêmicos, além de uma área inicial de neo-formação óssea. Nas paredes da cortical voltadas para a loja cirúrgica nota-se franca reabsorção óssea, com a instalação de várias unidades de reabsorção. Na cortical oposta observa-se formação de osso subperiostal e, no mesmo nível da loja cirúrgica nota-se formação de tecido cartilaginoso. Não há presença de periósteo. O espaço medular mostra-se preenchido com medula de padrão normal (Fig. 7).     

Grupo experimental de 10 dias:        

Os fragmentos de tíbias dos animais deste grupo experimental mostram neo-formação óssea ocupando grande extensão do canal medular, iniciando-se à distância da loja cirúrgica. O osso neoformado mostra-se ricamente celularizado, com grande quantidade de osteócitos e de espaços medulares, caracterizando formação trabecular,        

É de extrema importância esta linha de pesquisa sobre os materiais aloplásticos implantares, constituindo-se seu emprego em mais um recurso a ser aplicado principalmente na clínica cirúrgica especializada, para o preenchimento de falhas ósseas, buscando-se desta maneira, um reparo mais adequado a esta área, tendo em vista principalmente a colocação de implantes, num curto espaço de tempo.        

Nos resultados obtidos na presente investigação por implantes de osso liofilizado + aglutinógeno + membrana de osso bovino liofilizado, pôde-se constatar através da análise microscópica que após 40 dias as lojas cirúrgicas encontravam-se praticamente reparadas, com tecido ósseo pouco trabeculado e, medula óssea com aspectos de normalidade.        

Estes achados podem ser perfeitamente comparados àqueles encontrados por outros autores, que além de constatarem esta ocorrência microscopicamente, ainda verificaram estes        

mesmos achados clínica e radiograficamente , demonstrando-se assim, as propriedades destes materiais no reparo de uma loja cirúrgica, bem como sua capacidade osteoindutora, além de mostrarem-se totalmente biocompatíveis (Quadro 1).        

Durante a técnica cirúrgica observou-se que estes materiais do mesmo modo que em outros experimentos, apresentavam características de fácil manipulação, podendo desta maneira serem facilmente trabalhados para sua colocação nas feridas cirúrgicas.(Quadro 1).        

Nesta pesquisa pôde-se verificar que estes materiais aloplásticos, tanto o osso liofilizado quanto a membrana, foram quase que perfeitamente reabsorvíveis após um período de 40 dias, não sendo necessário, principalmente para as membranas, a necessidade de um segundo tempo cirúrgico, tornando-os assim, muito mais acessíveis aos profissionais da área, no que diz respeito à conscientização de seus pacientes para seu recebimento, evitando-se assim outro tempo cirúrgico para a remoção da membrana, no caso das não reabsorvíveis, apesar do reparo adequado.    

Foram encontradas outras pesquisas onde foram obtidos resultados que diferem daqueles observados nesta investigação, podendo-se atribuir este fato à tentativa de alguns autores em descobrir novas aplicações e subsídios desses materiais aloplásticos implantares. Em outra investigação, estudo comparativo foi efetuado entre osso autógeno e osso liofilizado, para o levantamento de mucosa de seio maxilar concluindo-se pela melhor qualidade do osso autógeno utilizado, conclusão parecendo-nos óbvia, tendo em vista o material utilizado - osso da própria pessoa - apesar do maior desgaste a que deva ser submetido este paciente, para a retirada desse osso (Quadro 1), além do altíssimo custo da cirurgia, que tornaria o processo praticamente restrito a determinadas classes sociais. Este é o principal fator em que se baseia o estudo dos presentes materiais, para tornar seu custo bastante acessível, tanto para os profissionais quanto para os clientes menos favorecidos.            

Grupo experimental de 20 dias:        

Neste grupo experimental observa-se nos fragmentos da tíbia, formação óssea trabecular, com espaços medulares amplos e celularizados, com osteócitos e revestido por osteoblastos. A formação óssea inicia-se junto à cortical oposta e da periferia para o centro preenche parcialmente a loja cirúrgica. Na superfície da loja cirúrgica notam-se pequenos e poucos fragmentos amorfos acelulares e eosinófilos, lembrando osso desvitalizado e, de permeio há infiltrado inflamatório MN, encontrando-se também alguns clastos multinucleados e CGMI. Recobrindo a loja cirúrgica nota-se tecido conjuntivo fibroso e células inflamatórias MN. Extensa formação de tecido fibroso, celularizado, ocupa a periferia da loja cirúrgica, interpondo-se entre esta e o tecido ósseo neoformado. As paredes das corticais ósseas voltadas para a loja cirúrgica mostram-se recortadas e revestidas por osteoblastos, além da presença de linhas de reversão. O canal medular mantém-se preservado à distância da loja cirúrgica e com padrão de normalidade. Parcialmente as corticais mostram, externamente, periósteo e inserção de tecido muscular (Fig. 11).         

Grupo experimental de 40 dias:        

Nota-se neste grupo experimental, tíbias com lojas cirúrgicas praticamente reparadas com tecido ósseo pouco trabeculado, com arranjo parecido aos das corticais, com canal medular total ou parcialmente restabelecido. O limite entre as paredes remanescentes das corticais e do osso neoformado é nítido. A formação óssea preenche a loja cirúrgica não ultrapassando seu limite externo. Não se observa infiltrado inflamatório e fragmentos de material amorfo e acelularizado. A medula óssea apresenta aspectos de normalidade, inclusive próximo ao espaço ocupado anteriormente pela loja cirúrgica (Fig. 13).         

Grupo controle:        

Os cortes microscópicos das tíbias dos animais dos grupos controle mostram padrões de normalidade relativos à neo-formação óssea, observando-se no período de 3 dias a formação de coágulo sangüíneo além de restos de tecido ósseo amorfo e desvitalizado em toda a loja cirúrgica (Fig. 6). Neste período constatou-se intenso infiltrado inflamatório, predominantemente mononuclear, com presença de clastos multinucleados junto aos fragmentos de tecido ósseo. A partir do período de 7 dias nota-se áreas inicias de neo-formação óssea na periferia das lojas cirúrgicas, com presença de grande quantidade de osteoblastos e produção de tecido osteóide (Fig. 8). Nos grupos de 10 (Fig. 10), 20 (Fig. 12) e 40 dias (Fig. 14), o padrão de neo-formação óssea mantém-se uniforme, mudando-se apenas a quantidade de sua formação, culminando com o preenchimento da loja cirúrgica já a partir do período de 20 dias. O espaço mostra-se com aspecto de normalidade compatíveis com a remodelação óssea, exibindo reparação ao final do período experimental.      

CONCLUSÕES        

Do exposto parece lícito concluir que:        

1. Esses materiais são de fácil manuseio.        

2. São materiais reabsorvíveis, dispensando um segundo procedimento cirúrgico.        

3. São materiais biocompatíveis.        

4. Favorecem um preenchimento adequado de toda a loja óssea.       

5. São eficaz no reparo de lesões ósseas.        

* Esses três materiais são desenvolvidos no Departamento de Bioquímica da FOB-USP.

Fotos

    
Fig. 1 - Aspecto do preparo da cavidade para o recebimento do material aloplástico implantar.

Fig. 2 - O material implantar "Osseobond" colocado na cavidade.  

Fig. 3 - O material implantar "Osseobond" colocado na cavidade e protegido pela membrana Dentoflex.   

Fig. 4 - Aspecto da sutura final no experimento realizado.   

Fig. 5 - Fotomicrografia experimental com 3 dias:   

     Fig. 6 - Fotomicrografia controle com 3 dias:   

Fig. 7 - Fotomicrografia experimental com 7 dias: Áreas de neoformação óssea (ON) à partir da periferia, remodelação da cortical óssea (c), com intensa atividade celular na região, neovascularização (·) e presença de células inflamatórias (®) - Aumento original de 48x.   

Fig. 8 - Fotomicrografia controle com 7 dias: No fundo da loja cirúrgica tem-se neoformação óssea (ON), com presença de células osteoblásticas (Ù) e neovascularização (·) - Aumento original de 100x.

Fig. 9 - Fotomicrografia experimental com 10 dias: Da periferia para o centro da loja cirúrgica observa-se neoformação óssea (ON), presença de células osteoblásticas (Ù), remodelação da cortical óssea (c), neovascularização (·) e presença de células inflamatórias (®) - Aumento original de 48x.

Fig. 10 - Fotomicrografia controle com 10 dias: No meio da loja cirúrgica nota-se neoformação óssea (ON) com presença de células osteoblásticas (Ù), remodelação da cortical óssea (c) e, neovascularização (·). Aumento original de 48x.   

Fig. 11 - Fotomicrografia experimental com 20 dias: Do fundo para a periferia da loja cirúrgica nota-se neoformação óssea (ON), com presença de células osteoblásticas (Ù) e formação de tecido osteóide (TO). Remodelação da cortical óssea (c) e indício de células que formarão a medula óssea (MO) - Aumento original de 48x.

Fig. 12 - Fotomicrografia controle com 20 dias: No fundo da ferida cirúrgica observa-se neoformação óssea (ON), focos hemorrágicos (H), com presença de células que formarão a medula óssea (MO) - Aumento original de 48x.   

Fig. 13 - Fotomicrografia experimental com 40 dias: Vista panorâmica da loja cirúrgica com fechamento da ferida (ON) e remodelamento das corticais ósseas (c). Presença de medula óssea (MO), com maior quantidade de células amarelas (CA) em relação às vermelhas (CV) - Aumento original de 16x.

Fig. 14 - Fotomicrografia controle com 40 dias: Preenchimento ósseo (ON) da cavidade cirúrgica, com formação de medula óssea (MO), com presença de maior quantidade de células vermelhas (CV) em relação às amarelas (CA) - Aumento original de 48x.

Veja outros Artigos Científicos sobre Biomateriais em nosso Site: http://www.dentoflex.com.br