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REPARAÇÃO DE FERIDAS DE EXTRAÇÃO DENTAL SUBMETIDA AO TRATAMENTO COM RAIO LASER - ESTUDO HISTOLÓGICO EM RATOS

LASER RAY EFFECTS ON WOUND HEALING OF DENTAL EXTRACTION - HISTOLOGICAL STUDY IN RATS

Podemos conceituar processos de reparo em feridas de extração dental, ao conjunto de eventos biológicos que ocorrem no interior do alvéolo, a partir da exodontia e que tem como objetivo fundamental preencher completamente o alvéolo dental com tecido ósseo.
A partir do clássico trabalho sobre o processo de reparação em feridas de extração dental desenvolvido por EULER (19), vários pesquisadores procuram estudar os fenomenos biológicos envolvidos e, através de estudos experimentais e clínicos, utilizando-se de método radiográfico, histológico e histoquímico,procuraram estabelecer os padrões normais deste processo de reparo (3,39,41,57).
A literatura tem demonstrado vários trabalhos que procuraram avaliar o processo de reparação alveolar frente a presença de vários fatores, locais e/ou sistêmicos. Dentre os fatores sistêmicos já estudados, a administração do paratôrmonio (50), glicocoticóides (3,55), o diabetes (23), o hipotireoidismo (40), a tireoparatireodectomia (22), a hipertenção renal crônica (10), a lesão da eminência médica hipotalâmica (15), a desidratação (9), estado gestacional (53) e aguardente de cana (61), retardam a cronologia de reparo do processo alveolar.
Outros estudos, no entanto, tem procurado avaliar o reparo alveolar frente a presença de fatores locais. Assim, várias substâncias aloplásticas foram estudadas como: Proplast (52,65), estimulação ultra-sônica na área alveolar (68), osso anorgânico (54), esponja de polivinil-álcool (58), osso sintético (12), esponja de poliuretano (40), gesso Paris (64), Apernyl (11), esponja de gelatina (51), cera óssea (56) e colágeno microcristalino (24), cujos resultados demonstram, que na quase totalidade, promovem retardo do reparo alveolar.
Com o advento do primeiro aparelho de Raio Laser criado por MAIMAN (29), utilizando o rubi como meio ativador, surgiu uma nova opção terapêutica não só na medicina quanto na Odontologia.
Tem sido demonstrado ao longo dos anos, que os efeitos biológicos do Laser de bioestimulação se processa de diferentes formas: quer através da indução da atividade mitódica das células epiteliais (26), modificando a densidade capilar (37), estimulando a microcirculação local (16,20,35) e principalmente aumentando a síntese do colágeno, não só " ïn vitro" (1,7,34) quanto" ïn vivo" (2,14,20,31,32,34,59).
Na análise da literatura observamos poucos trabalhos que estudaram a aplicação do Raio Laser de bioestimulação, principalmente no preparo alveolar, não não só em condições normais (43,62,63) ou em casos de alveolite (17,21,27,30,42,46). Estes trabalhos, no entanto, fundamentam-se em observações clínicas (63) quando não, utilizaram aparelho laser protótipo (43), sem considerar os tipos diferentes de meio ativador utilizado, de Hélio-Neônio (43) ou Arsênio e Gálio (62,63), com comprimento de onda também variado de 632,8 nanômetros (43) e 904 nanômetros (62,63), além de outras variáveis, como o tempo de exposição empregado, de 5 minutos (62), 6 minutos (43) e de 8 minutos (63).
Desta forma face a escassez de trabalhos científicos bem documentados, aliados à diversidade de metodologia encontrada, além da divergência de resultados e, com o instituto de contribuir para oferece bases mais sólidas e científicas para a utilização clínica do Raio Laser, é que propomos no presente estudo, avaliar do ponto de vista histológico em ratos, o processo de reparação em feridas de extração dental submetidas ao tratamento com Raio Laser.

Para o desenvolvimento do presente estudo, foram utilizados 32 ratos (Rattus norvegicus,albinus,Wistar), machos,com peso variando entre 160 e 220 g, os quais procediam do Biotério da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba, UNESP.Os animais mostravam-se sadios, em condições de sofrerem os experimentos propostos e foram mantidos em gaiolas individuais, recebendo ração granulada comercial (Ração ativada "Produtor"- Anderson Clayton S/A) e água "adlibitum"antes e durante todo o período experimental.
Nos ratos,após a anestesia por inalação de éter sulfúrico, foi realizada a exodontia do incisivo superior do lado direito, utilizando-se uma pinça adaptada por OKAMOTO & RUSSO (40). Em seguida os animais foram divididos em seguida os animais foram divididos em dois grupos.
No grupo I, também denominado de grupo Controle, constituído por 16 ratos, após a exodontia do incisivo superior do lado direito, os animais não receberam qualquer tratamento intra alveolar,recebendo apenas sutura das bordas alveolares, com fio de seda 4-0 (Sutupack Ethicon - Johnson & Johnson).
No grupo II, também denominado de Grupo Experimental, constituído por 16 ratos, após a exodontia do incisivo superior do lado direito e sutura das bordas da ferida, os animais foram submetidos a aplicação única de Raio Laser realizada imediatamente após a sutura.
O aparelho de Raio Laser utilizado no presente estudo foi o CAVITY-D1-UP, com as seguintes especificações: Laser de emissão infravermelha, emissor de Arsênio e Gálio (As-Ga), 904 nanômetros de comprimento de onda,potência de pico - 10 Watts, potência média de saída - entre 0,5 a 3,5 mW, frequência de repetição - entre 500 a 3.700 Hertz, forma de aplicação - fibra ótica.
O Raio Laser foi aplicado em todos os animais do Grupo Experimental, de forma "pontual", diretamente sobre a mucosa gengival vestibular, na altura da porção média do alvéolo dental, com frequência de 2 mW de potência e 3 minutos de tempo de exposição.
Decorridos 3,7,14 e 21 do ato cirúrgico e pós aplicação do Raio Laser, os animais, em número de 4 para cada grupo, foram sacrificados, também por inalação de éter sulfúrico. Após o sacrifício, o maxilar superior esquerdo foi separado do direito através de uma lanceta. Por intermédio de uma tesoura de ponta romba, executamos um corte tangenciando a face distal do terceiro molar, possibilitando desta forma a obtenção da porção da maxila, contendo o alvéolo dental tratado ou não com Raio Laser.
As peças obtidas foram fixadas em formol a 10% por um período mínimo de 24 horas, e em seguida, descalcificadas em solução de citrato de sódio e ácido fórmico em partes iguais (38).
Concluída a descalcificação, as peças foram incluidas em parafina, orientadas de forma a permitir cortes dos alvéolos dentais, no seu sentido longitudional. Os cortes semi- seriados com 6 micrômetros de espessura, foram corados pela técnica da hematoxilina e eosina.

Boa parte do alvéolo dental acha-se ocupado por coágulo sanguíneo exibindo grande número de macrófagos em seu interior.
Junto à parede óssea lingual, pode ser evidênciado o remanescente do ligamento periodontal rico em fibroblastos e vasos sanguíneos. No terço cervical mais próximo a abertura do alvéolo, nota-se moderado número de polimorfonucleares neutrófilos. Ao nível do terço médio e apical, pode ser evidenciado,adjacente ao ligamento periodontal, moderado número de fibroblastos e capilares neoformados junto ao coágulo sanguíneo (Fig.01).
O epitélio da mucosa gengival mostra discreta proliferação e o conjuntivo subjacente exibe moderado número de linfócitos e macrófagos.

O alvéolo dental acha-se parcialmente ocupado por coágulo sanguíneo, mostrando as mesmas características observadas no grupo anterior. Junto à parede óssea alveolar, observa-se remanescente do ligamento periodontal bem vascularizado e rico em fibroblastos. Junto ao terço cervical, evidencia-se também, moderado número de polimorfonucleares neutrófilos.
Adjacente ao ligamento periodontal, nota-se ao nível do terço médio e apical, intensa proliferação fibroblástica e capitalar (Fig. 02). Na área de neoformação conjuntiva exibe pouco coágulo sanguíneo, notando-se ainda, moderado número de linfócitos e macrófagos.
O epitélio da mucosa gengival, com solução de continuidade, exibe discreta proliferação e o conjuntivo subjacente mostra moderado número de linfócitos e macrófagos.

Ao longo dos três terços alveolares, acham-se preenchidos parcialmente por tecido conjuntivo neoformado imaturo, exibindo grande número de fibroblastose capilares neoformados. Em inúmeros pontos observa-se ainda, pequena quantidade de coãgulo sanguíneo sem organização.
Ao nível do terço médio no lado lingual, observa-se pequenas espículas ósseas neoformadas com númerosos osteoblastos em suas bordas (fig. 03).
O epitélio da mucosa gengival, na maioria dos casos recobre praticamente o alvéolo dental. Em alguns espécimes o epitélio recobre aproximadamente os dois terços da abertura alveolar.

Neste grupo, com exeção de pequenas áreas junto ao terço cervical, o alvéolo dental acha-se ocupado por tecido conjuntivo neoformado mais desenvolvido quando comparado ao grupo conrole. Assim, são poucas áreas ocupadas por coágulo sanguíneo e, junto à parede óssea alveolar lingual, nota-se pequenas trabéculas ósseas imaturas com numerosos osteoblastos em suas bordas (fig. 04). Nas proximidades, observa-se a presença de tecideo conjuntivo rico em fibras colágenas. Por outro lado, o eptélio da mucosa gengival, recobre totalmente a abertura do alvéolo dental.

Toda a extenção do alvéolo dental encontra-se ocupada por tecido conjuntivo neoformado apresentando diferentes características conforme o terço considerado. Assim junto ao terço médio e apical, podem ser evidenciadas trabéculas ósseas delgadas ocupando aproximadamente 40% da área (fig. 05). O tecido conjuntivo entre as trabéculas é bem vascularixado e rico em fibroblastos.
Junto ao treço cervical, nota-se a presença de tecido ósseo neoformado apenas junto à parede óssea alveolar. Nas demais áreas, observa-se a presençca de tecido conjuntivo com moderado número de fibroblastos.
O epitélio da mucosa gengival, recobre o alvéolo dental em sua totalidade.

Os três terços alveolares encontram-se ocupados por trabéculas ósseas neoformadas apresentando diferentes características. Assim, ao nível dos terços médio e apical, as trabéculas ósseas são bem desenvolvidas, ocupando aproximadamente 70% da área (fig. 06). No espaço intertrabecular pode ser evidenciado tecido conjuntivo bem vascularizado e rico em fibroblastos. Junto ao terço cervical, as trabéculas ósseas são mais delgadas e ocupam em torno de 50% da área. No espaço intertrabecular, nota-se a presença de tecido conjuntivo bem vascularizado e rico em fobroblastos.
O epitélio da mucosa gengival, recobre o alvéolo dental em sua totalidade.

Os terços médio e apical do alvéolo dntal, com exeção de alguns pontos, acham-se preenchidos por trabéculas ósseas espenssas com canais medulares bem definidos (fig.07). Junto ao terço cervical, no entanto, observa-se na maioria dos espécimes , áreas sem diferenciação óssea exibindo tecido conjuntivo ora com moderado número de fibroblastos, ora com elevado número destas células.

Em todos os espécimes os três terços alveolares encontram-se praticamente ocupados por trabéculas ósseas espensas com canais medulares geralmente reduzidos (fig. 08). Ocasionalmente podem ser observadas pequenas áreas com trabéculas delgadas notadamente junto ao terço cervical.

Na análise dos resulados obtidos no presente estudo, observamos que as feridas go Grupo Experimental, submetidas ao tratamento com Raio Laser, quando comparadas com as do Grupo Controle, mostram processo de reparação mais evoluido, caracterizado por organização mais rápida do coágulo sanguíneo, intensa proliferação vascular e fibroblásticas, formação óssea mais precoce e mais intensa, além do fechamento epitelial mais rápido do alvéolo dental.
Nossos resultados revelam também, no período inicial de 3 dias, que as feridas do Grupo Experimental, mostram formação mais precoce do tecido de granulação cicatricial, caracterizado pela rápida organização e reabsorsão do coágulo sanguíneo além de intensa proliferação vascular e fibroblástica, óssea mais precoce e mais intensa, além do fechamento epielial mais rápido do alvéolo dental.
Nossos resultados revelam também, no período inicial de 3 dias, que as feridas do Grupo Experimental, mostram formação mais precoce do tecido de granulação cicatricial, caracterizado pela organização e reabsorção do coágulo sanguíneo além da intensa proliferação vascular e fibroblástica. Estas observações tornaram-se mais evidentes no período de 7 dias, onde o alvéolo dental tratado com raio laser, apresentou-se totalmente preenchido com tecido conjuntivo neoformado com características mais desenvolvidas que o Grupo de Controle.
Estes resultados são corroborados por GARCIA (20) que estudou o processo de reparação de feridas abertas provocadas na região dorsal de atos e submetidas ao tratamento com Raio Laser de Ar-Ga, de 904 nanômeros de comprimento de onda. Através de alvaliações clínicas, biométricas e histológicas observou que as feridas tratadas com Raio Laser mostravam aceleração do processo de reparação, com elevada ploriferação vascular e fibroblástica, além de demonstrar o tecido conjuntivo bem desenvolvido e rico em fibras colágenosas. Tais eventos histológicos eram mais evidentes nos períodos de 3 a 7 dias. Estas observações fortalecem as evidências de que a ação do Raio Laser se processa a nível vascular e celular, com maior intensidade nas fases iniciais do processo de reparo.
A intensa ploriferação vascular observada no presente estudo é corroborada por inúmeros trabalhos que demostram a capacidade do Raio Laser estimular a microcirculação local (5, 13, 16, 20, 35). Por outro lado, a intensa proliferação fibroblástica também observada no presente estudo, provavelmante se deva à ação do Raio Laser sobre os fibroblástos presentes no remanescente do ligamento periodontal. Esta observação é fortalecida por vários autores que tem demonstrado a capcidade do Raio Laser estimular a atividade dos fibroblásticos não só ´´invitro´´ quanto ´´in vivo´´ (6, 13, 14, 26, 60).
Muito embora tem sido apresentado na literatura, várias formas de ação do Raio Laser (1, 28, 44, 49),há relato de que os fibroblástos de tecido gengival humano quando tratado com Raio Laser, Mostram-se a nível de microscopia eletrônica, mais numerosos, comsuas organelas citoplásticas (mitocôndrias, retículo endoplasmático rugoso) aumentadas, além de demonstrar maior atividade enzimática (enzimas ovidativas, leucinas aminopeptidases) (13).
Esses resultados fortalecem os achados clínicos de VERPLANKEN (63) que observou em humanos, que os alvéolos dentais tratados com Raio Laser de Ar-Ga, mostraram reparação mais rápida demosntrando maior indíce de contração das bordas da ferida cirúrgica.
Nossos resultados são corroborados por TAKEDA (62) que estudou a reparação alveolar em molares de ratos, submetendo-os ao tratamento com Laser de Arsênio e Gálio ( Ar-Ga), com comprimento de onda de 904 nanômetros, 25 mW de potência, densidade energética de 20 Joules (J / cm²) e tempo de exposição de 5 minutos. Resultados semelhantes aos obtidos em nosso estudo, foi observado por NICCOLI (43) utilizando-se de um protótipo de aparelho Raio Laser de Hélio-Neônio (He-Ne), com comprimento de onda de 632,8 nanômetros 0,75 mW de potência e 1 Joule de densidade energética, com tempo de exposição de 6 minutos.
Na análise comparativa destaes trabalhos, observamos que encontrammos respostas biológicas semelhantes quando foi utilizado aparelho Laser com Comprimento de onda de 904 nanômetros idênticos ao do nosso estudo (62) ou com comprimento de onda de 632,8 nanômetros (43), embora alguns autores acreditam que o fator comprimento de onda possa influenciar na resposta biológica (26). este fato fortalece ainda mais a observação de Garcia (20) que caham a atenção de que o fator comprimento de onda pode não representar o fator mais importante para a obtenção dos efeitos fotobiológicos, pois estudando o processo de reparação de feridas cutâneas observou respostas biológicas variáveis, quando utilizou didiferentes ferquências e potências do Raio Laser. Este fato é corroborado também por outros trabalhos que observaram resultados biológicos diferentes quando empregaram diferentes frequências (18).
Por outro lado, outra condição de fundamental importância para a utilização do Raio Laser é o fator dose energética e tempo de exposição. Estes podem trazer danos ao sistema intracelular levando inclusive a morte celular (43).
Desta forma dentro da metodologia utilizada no presente estudo, obtivemos resutados biológicos satisfatório utilizando tempo de exposição (3minutos) inferior aos encontrados na literatura (43,62). Comparativamente, observamos que nossos resultados se fortalecem pelo fato de que utiliziamos pequena potência (2 mW) e pequena densidade de energia (3Joules/cm²) em relação a outros trabalhos (62), que utilizou 25 mW e 20 Joules/cm².
Outro fato observado no presente estudo, foi a formação óssea mais precoce evidente no período de 7 dias, nas feridas do Grupo Exprimental. Este fato tornou-se mais evidente no período de 14 dias e com maior extenção do alvéolo dental, no período de 21 dias.
Muito embora o mecanismo de ação do raio Laser sobre a reparação óssea não esteja totalmente esclarecido, acreditamos que o Raio Laser provavelmente possa estimular as células memesenquimais indiferenciadas, presentes no remanescente do ligamento periodontal e, consequentemente , promover maior diferenciação celular osteoblástica, o que promoveria formação óssea alveolar mais intensa, fato evidente no presente estudo nas feridas tratadas com Raio Laser em comparação com as feridas não tratadas (controles).
Quanto ao fechamento epitelial mais rápido das feridas alveolares do Grupo Experiemntal, nítida a partir do período de 7 dias, corrobora os achados preliminares de outros estudos (20, 25, 26, 33, 36).
GARCIA (20) salienta que várias são as hipóteses que procuram explicar a proliferação apitelial no processo de reparação de feridas. Assim o Raio Laser poderia interferir em diferentes mecanismos como a produção de "trefonas" ou "hormônios das feridas " (47), estimular a formação de "complexo de de adrenalinacalona"(8), ou promover a "interrupção do fornecimento de catecolaminas para área cirúrgica"(48) ou promover "aumento da tensão de oxigênio local" através o aumento da vascularização (45).
Desta forma, forma, com a metodologia utilizada no presente estudo, torna-se difícil esclarecer o mecanismo pelo qual o Raio Laser promoveu diferentes eventos biológicoa favoráveis à reparação. No entanto, é válido ressaltar que o Raio Laser promoveu uma aceleração da cronologia dos eventos biológicos da reparação de feridas de extração dental, visto que houve formação mais precoce do tecido de granulação cicatricial, formação óssea mais precoce e mais intensa e fechamento mais rápido das bordas da ferida alveolar. Por outro lado, acreditamos na nescessidade de novos estudos que possam esclarecer ainda mias os intrínsecos mecanismos da reparação alveolar.

Baseado na análise dos resultados abtidos no presente estudo, parece-nos lícito concluir que:
1- as feridas do Grupo Experimental, tratadas com Raio Laser, demonstraram aceleração do processo de reparação alveolar, caracterizado por:
a) formação mais rápida do tecido de granulação cicatricial;
b) formação mais precoce e em maior extensão do tecido ósseo alveolar;
c) Fechamento mais rápido das bordas epiteliais das feridas.
2- os eventos histológicos mostraram-se mais favoráveis durante toda a pesquisa.
3- No final do experimento, 21 dias, as feridas do Grupo Controle, demonstrando formaçào óssea em toda a extenção alveolar.


Fig. 01 - GRUPO CONTROLE. 3dias. Terço adjacente ao ligamento periodontal evidenciando moderado número de fibroblástos e capiliares neoformados. H. E. 160 X.	Fig. 02 - GRUPO EXPERIMENTAL. 3 dias. Terço médio adjacente ao ligamento periodontal exibindo intensa proliferação fibroblástica e capilar. H. E. 160 X.

Fig. 03 - GRUPO CONTROLE. 7 dias. Terço médio evidenciando áres com pequenas espículas ósseas neoformadas com numerosos osteoblastos em suas bordas. HE. 63 X.	Fig. 04 - GRUPO EXPERIMENTAL. 7 dias. Terço médio, lado lingual, mostrando áreas com pequenas trabéculas ósseas neoformadas notando-se nas proximidades, tecido conjuntivo rico em fibras colágenas. H. E. 63 X.

Fig. 05 - GRUPO CONTROLE. 14 dias. Terço médio do alvéolo evidenciando trabéculas ósseas delgadas ocupando, aproximadamente, 40% da área. H. E. 63 X.	Fig. 06 - GRUPO EXPERIMENTAL. 14 dias. Trabéculas ósseas bem desenvolvidas ocupando em torno de 70% de área, notando-se ainda a presença de tecido conjuntivo bem vascularizado e rico em fibroblástos. H. E. 63 X.

Fig. 07 - GRUPO CONTROLE. 21 dias. Terço médio evidenciando trabécuals ósseas espenssas com canais medulares bom definiodos. H. E. 63 X.	Fig. 08 - GRUPO EXPERIMENTAL. 21 dias. Terço médio do alvéolo com tranbéculas ósseas espensas exibindo áreas com canais reduzidos. H. E. 63 X.

1- BENEDICENTI, La valutazione dell effetto della luce Laser 904 nm nella circolazione ematica in vivo (Protocollo sperimentale su mesentere di ratto Sprague Dowley). Parodont. Stomat. (Nuova), v.22, n.1, p 37-46, 1983.
2- CABRERA, M. A. Estudo histológico do processo de reparo de alvéolos dentais em ratos desidratados. Araçatuba. Faculdade de Odontologia - UNESP, 1982. Dissertação de Mestrado.
3- CASTRO, A. L.; CALLESTINI, E. A.; CARVALHO, A.C.P.; OKAMOTO, T. "Sinthetic bone" implants following tooth extractions. A histological study in rats. Bull. Tokio dent. Coll., v.4, p.193-199, 1970.
4- COLLS, J. La terapia laser atual. Barcelona: Centro de documentación Laser de Meditec, 1984.
5- GARCIA, L. C.; CARVALHO, P. S. P.; OLIVEIRA, J. A. G. P. Ação da radiação laser na reparação de feridas de extrato dental infectadas. Estudo histológico em dental infectadas. Estudo histológico em ratos. RGO. v.43, p.191-194, 1995.
6- MAIMAN, T. H. Stimulated optical radiation in ruby. Nature, v.187, p.493-494, 1960.
7- MESTER, E. Stimulation of wound healing by means of laser rays. Acta Chir. Acad. Sci. Hung.; v.14, p.347-354, 1973.
8- MESTER, E.; JASZSAGI-NAGY, E. The effect of laser radiation on wound healing and collagen biosynthesis. Stud. Biophys., v.35, p.227-230, 1973.
9- NICCOLI FILHO, W. D. Efeitos dos raios laser tipo Hélio-Neônio (He-Ne) no processo de raparo em feridas de extração dental. Estudo histológico em ratos. Araçatuba: UNESP, 1991. Tese / Doutoramento / Faculdade de Odontologia. UNESP-1991.
10- VILLELA-SANTOS, P. Jr. Implante de "proplast"em alvéolo dental após exodontia por alveolectomia total. Estudo histológico em cães. Araçatuba, Faculdade de Odontologia - UNESP. 1980. Dissertação de Mestrado.

Mais referências, veja: - Revista da Faculdade de Odontologia de Lins ( FOL ) Vol. 9 - nº 1, págs. 33 a 41. - jan/jun. 1996.


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